4个人源化DMD小鼠模型携带外显子44、45、51或53缺失，侧翼外显子跳跃可恢复抗肌萎缩蛋白

在mdx背景下构建人DMD外显子44、45、51或53缺失的4个小鼠模型；8周龄雄鼠腓肠肌缺乏或仅有痕量抗肌萎缩蛋白，肌内注射vivo-morpholino跳跃侧翼外显子可恢复蛋白。

研究背景与待解问题

杜氏肌营养不良（DMD）由DMD读框破坏引起。多学科护理下，患者多在十几岁丧失行走、20岁前后需辅助通气，于生命的第二至第四个十年死于呼吸或心力衰竭。位于基因中段、不破坏读框的变异则表现为较轻的Becker型。外显子跳跃与基因编辑都是变异特异的，必须打人源序列。

最常用的mdx小鼠是鼠Dmd第23外显子无义突变，用来验证的是鼠序列。人源hDMD酵母人工染色体（YAC）有完整2.3 Mb人基因，能挽救mdx表型，但整合在小鼠染色体5上、且为尾对尾双拷贝。先前的hDMDdel52/mdx已证明可做临床前工具，再敲别的外显子时，有把两个拷贝3′端一并切掉的风险。van Putten、Aartsma-Rus、Hohenstein等要解决的是：怎样在这套双拷贝YAC上干净地做出患者最常见的单外显子缺失，并证明人源ASO仍能把蛋白救回来。

研究设计

hDMD/mdx携带尾对尾两份人DMD。预筛用两套PCR：一套跨过预期缺失，确认目标外显子已删且3′侧仍在；一套打在缺失内部，把只删掉其中一个拷贝的克隆或动物剔除。del44在先前分离的hDMD/mdx胚胎干细胞中用打内含子43与44的Cas9 RNP完成，经囊胚注射建系。del45、del51、del53直接在合子电转：尽可能用纯合hDMD/mdx雄鼠与C57BL/6J雌鼠，使每个胚胎只带一套尾对尾插入。随后回交到C57BL/6J的mdx，以减少把mdx突变带入所需的回交代数。

跳跃验证在8周龄雄鼠：针对del44跳外显子43、del45跳44、del51跳50、del53跳52。连续两日注射腓肠肌与肱三头肌双侧；最后一次注射后2周取材，同一块肌的冰冻切片同时做RNA与蛋白。

核心结果

双拷贝预筛使四种缺失都能建系

del44胚胎干细胞有14%的候选克隆通过两步预筛；桑格测序只见到一种缺失，提示两个YAC拷贝得到了相同删除。del45同样只见到一种缺失。del51第一轮往往只丢掉一个拷贝，第二套向导打在已缺失区段内，才得到双拷贝都缺外显子51的创始鼠。del53最初是混合测序峰，TOPO克隆12个克隆后拆出两个拷贝上的两种不同缺失。ddPCR显示，除目标外显子缺失外，基因其余抽查外显子仍为两拷贝。

8周龄已出现抗肌萎缩蛋白缺失与mdx样病理

健康hDMD/mdx腓肠肌的人源抗肌萎缩蛋白达野生型水平。hDMDdel44/mdx与hDMDdel53/mdx完全缺失；hDMDdel45/mdx与hDMDdel51/mdx为痕量，免疫荧光上del51几乎看不到阳性。四种缺失模型均出现肌纤维变性与再生、炎症和纤维化，作者认为与mdx/BL6相当。Western每品系上样两个个体，del53用同一只鼠的左右肢。

侧翼外显子跳跃恢复截短蛋白

每品系2或3只雄鼠的左右腓肠肌与肱三头肌，RT-PCR均见到目标外显子跳跃。Western在腓肠肌与肱三头肌检测到截短抗肌萎缩蛋白。作者在讨论中指出，hDMDdel44/mdx跳外显子43后蛋白恢复偏低，可能与缺少43–44的蛋白稳定性较差有关，也可能只是ASO设计未优化；正文未给出恢复百分比。50 μg的43/44跳跃不足以恢复蛋白，故这两条用了100 μg。

机制解读

原文实验证明：在双拷贝人DMD YAC上删除外显子44、45、51或53后，mdx背景下人源抗肌萎缩蛋白消失或只剩痕量，8周龄腓肠肌出现mdx样组织病理。针对侧翼外显子的人源vivo-morpholino可诱导跳跃、恢复读框，并在腓肠肌与肱三头肌重新出现截短蛋白。ddPCR表明目标外显子缺失而其余抽查外显子仍为两拷贝，说明表型不是整段YAC丢失。

作者推测：del45与del51的痕量蛋白来自部分肌纤维的自发跳跃，与临床上适合跳外显子44的患者可见痕量蛋白相一致；这一解释没有在本文用单纤维或测序直接证明。他们也指出，双拷贝YAC对人源蛋白表达量更接近健康对照，但对基因编辑疗法可能低估打靶效率。

局限与不确定

• 自然病程（运动功能、组织学与分子读出随年龄的变化）作者写明仍在进行，本文只有8周龄雄性、以腓肠肌为主的横断面。
• 跳跃实验每品系仅2或3只，局部肌内注射，无定量蛋白百分比、无肌力或全身给药数据，也未报告统计学检验。
• 双拷贝尾对尾整合使基因编辑效率可能被低估；del53两个拷贝的缺失并不相同。
• mdx背景本身比患者轻；痕量蛋白的自发跳跃假说未闭合。不能把局部概念验证读成临床有效的外显子跳跃方案。

临床/产业意义

加上已有的hDMDdel52/mdx，这四株覆盖患者最常见的单外显子缺失：外显子45（4%）、51（3%）、44（3%）、52（3%）。作者引用文献称，针对这些外显子的单外显子跳跃合计可覆盖超过50%的突变，但精确比例取决于一条缺失能否向前或向后跳。对人源ASO与向导RNA，这些模型的价值是序列匹配，而不是已经完成药效学定量。若要把它们用于基因编辑临床前研究，可能需要先按已发表策略改成单拷贝YAC。